为了更好的理解二抗，首先了解一下抗体结构，这是制备二抗的重要基础。

抗体结构

重链(Heavy chain，H链)：哺乳动物Ig的重链一共有五种,分别用希腊字母α、δ、ε、γ和 μ 来命名,相对应组成的抗体就称为 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM 五种抗体。

轻链 (Light chain，L链)：哺乳动物只有两种轻链：λ型和κ型，一个天然的Ig分子两条轻链总是相同的，但在同一个体内可存在分别带有κ或λ链的抗体分子，每一个抗体的轻链只有一个型：κ或λ型。

抗体的恒定区（constant region，C区）：

可变区和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性。恒定区和抗体效应功能相关，同一类型抗体的恒定区组成上是相同的。

重链 (Heavy chain，H链) 和轻链 (Light chain，L链)的恒定区（constant region，C区）分别称为CH和CL。位于H链靠近C端的3/4或4/5 和L链靠近C端的1/2区域。每个C区中均有由链内二硫键连接形成的肽环。这个区域氨基酸组成和排列在同一种属动物Ig同型L链和同一类H链中都比较恒定，如人抗白喉外毒素的抗毒素IgG与人抗破伤风外毒素的抗毒素IgG，它们的V区不相同，只能与相应的抗原发生特异性的结合，但其C区的结构是相同的，即具有相同的抗原性，应用马抗人IgG第二抗体（或称抗抗体）均能与这两种抗不同外毒素的抗体（IgG）发生结合反应。这是制备第二抗体，应用荧光素、同位素、酶等标记抗体的重要基础。

二抗的定义：

第二抗体（二抗）是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用一抗是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体（如IgG、IgM或IgA等）均具有反应性。

二抗与一抗的区别：

第一抗体就是常说的抗体，即能和抗原特异性结合。第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。也就是说，抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答，由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。

为什么标记二抗来检测以及二抗的作用：

一抗特异性地结合目标物，需要标记发光物质或者显色基团才能被检测出来。但是一抗只针对某一种特定抗原，如果每个一抗都标记成本太高。如果将信号(如荧光、放射性、化学发光或显色基团）标记在二抗上，利用一抗结合目标物，二抗结合一抗，就可以通过标记二抗间接检测目标物，大大节约抗体的标记成本和时间。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如Western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以偶联有酶的抗体或抗原来检测特异性的蛋白质），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗的设计原理：

根据同一种来源的同种亚型抗体的恒定区是保守的，以此充当抗原刺激机体产生的抗体可以识别同种亚型一抗，根据这一原理设计制备二抗。

抗IgG (H+L)恒定区：靶向一抗的重链和轻链恒定区。这些抗体也会与其他类(如IgE、IgD等)发生反应，因为这些类之间共享轻链。更广泛的表位识别(H+L)二抗使其适用于大多数需要二抗的免疫分析。

抗IgG Fc片段或重链恒定区：与抗IgG (H+L)二抗不同，靶向一抗Fc区域或重链的二抗具有类特异性，不会与其他类免疫球蛋白发生反应，因为每一种抗体的重链或者Fc片段是不一样的（见图2）。如果打算在Ip后进行Western blotting分析，建议使用重链特异性二抗来检测位于25kDa分子量附近的目标蛋白，以避免轻链的干扰。此外，Fab片段抗Fc二抗可用于一抗在多次标记实验孵育前预标记。

抗IgG轻链恒定区：靶向一抗的轻链(kappa或lambda)。这些抗体不与一抗重链反应，但识别其他免疫球蛋白类的共享轻链。例如，山羊抗人IgG Kappa轻链二抗不仅能识别IgG亚类，还能识别IgA、IgD、IgE、IgM等轻链。在Ip后进行Western blotting分析时，建议使用轻链特异性二抗来检测来检测位于55kDa分子量附近的目标蛋白，以避免重链的干扰。

抗IgG F(ab’)2片段恒定区：靶向于一抗的F(ab’)2片段区。由于识别了F(ab)区域的共享轻链，它们会与IgA、IgD、IgE、IgM等轻链发生反应。

二抗的优势：与仅使用标记一抗直接检测目标物相比，使用二抗识别一抗间接检测目标物具备多种优势。

通用性：二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用。

放大信号：一个一抗分子可以同时结合几个标记二抗分子，从而增强信号并提高检测灵敏度。在有些检测中，可使用生物素化的二抗和链霉亲和素偶联的标记分子来进一步增强信号。

允许进行多重检测实验：由于二抗具有物种特异性，因此可以将实验设计为使用源自不同物种的一抗来检测多种目标物。使用与具有不同波长发射光的荧光染料标记的二抗来检测不同的目标物。

保留互补位：一抗与标记分子的偶联，有可能会影响其抗原结合位点，也称为互补位。这将降低一抗与其靶抗原结合的能力。使用标记二抗后，可以在检测中使用未偶联的一抗而避免影响其与抗原的结合。

纯化方法：大多数二抗从经过免疫的动物血清纯化获得。通常二抗的纯化方法有亲和纯化（抗原亲和纯化，Protein G亲和纯化等），辛酸-硫酸铵纯化，分子筛纯化等。每种纯化方式对于抗体的纯度、纯化效率、纯化得率、纯化抗体的特异、纯化抗体的活性有不同程度影响。亲和层析纯化的抗体一般更受人们欢迎，因为这些产品的特异性较高，产生的非特异性条带和背景较低。 

亲和纯化是指将含有抗体的血清通过固相配体的多孔纯化树脂柱。亲和配体会与抗体互相结合，之后血清中其他未结合的成分可经过漂洗步骤去除，最后使用一种可破坏配体-抗体相互作用的缓冲液将抗体从树脂柱上洗脱并回收（即纯化抗体）。这种类型的纯化方法是通过使用可识别抗体的配体（如蛋白G）或可被抗体识别的配体（如目标抗原）来实现的。

交叉吸附：交叉吸附相当于另一种纯化二抗的方式，因为二抗通常是多抗，存在多种抗体亚型的混合，因此会存在交叉反应现象。例如某些羊抗小鼠IgG二抗可能会和兔源一抗存在一定程度的结合，对二抗进行交叉吸附纯化可以较好的去除来源于非目标抗体和蛋白的交叉反应性，从而提高抗体的特异性。

交叉吸附是指将亲和纯化的二抗通过一个固定有其它种属来源的抗体或血清蛋白的纯化柱。能够识别这些其它种属来源的抗体或血清蛋白的二抗将结合在纯化柱上从而被去除，通过这种方法可以获得交叉反应性更低的二抗，从而降低背景和提升抗体效价，交叉吸附的二抗通常用于多个靶标同时检测的场景，以便获得更好的测试效果。

如何选择二抗？

选择最合适的二抗主要需考虑以下因素：

❖确定一抗的宿主物种（例如，小鼠抗微管蛋白、兔抗 CD4）

❖选择适当的二抗宿主物种（山羊抗小鼠 IgG、驴抗兔 IgG）

❖考虑二抗的交叉反应性或特异性问题

❖标记物类型：和适合的酶、标签或荧光基团偶联以用于所选择的检测方法

❖Buffer状态成分：无菌液体或冻干、含PBS或Tris缓冲液、含载体蛋白或添防腐剂等

检测任何目标物都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，其中如何根据一抗的种属来源和类型选择二抗尤为重要。选择二抗的5个基本步骤：

1.选择正确的种属来源和反应物种

二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，如果一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

2. 选择正确的二抗形式

选择合适且正确的二抗形式，也是获得实验成功的关键之一。四种二抗形式Whole IgG、F(ab')2 、F(ab')、Fab如下图所示。

3. 抗体特异性的选择

要注意区分二抗的特异性和形式的不同，特异性指的是二抗识别的不同一抗亚型或某特殊区域；形式指的是二抗的不同结构形式。抗体的特异性主要基于以下三种形式：

（1）亚型特异性：除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。

单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果一抗是小鼠IgG，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgG抗体。如果单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

  (2）轻链（lambda，kappa）特异性：与所有类别的抗体反应，因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。

（3）Fc片段或重链特异性：这类抗体和重链或Fc部分反应，它们具是类别特异性，即γ链特异性抗体只与IgG反应，μ链特异性抗体只识别IgM，依此类推。

（4）针对整个抗体分子（H＋L）特异性：此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合，即与抗体分子的Fc、F(ab')2、Fab部分均可反应，anti- IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应（如IgM和IgA），因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链（κ链或λ链）。

（5）针对Fab片段特异性：这类抗体与重链轻链均可以结合，由于它们可以与轻链反应，它们同时也可以和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。

4. 二抗的种属来源

一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。选择相应的驴来源的二抗，就非常适合做类似双标的免疫实验。因为双标得2个一抗都抗才行，故选择第3个种源的抗体。

5.偶联标记的选择

一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶，荧光基团（FITC/Dylight/Alexa Fluor）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用biotin/avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

为了更好地理解荧光二抗，接下来为各位老师介绍其定义、作用原理、特点及选择要素。

荧光二抗是一种带有荧光基团标记的特异性抗体，其核心特征是耦联了荧光团（可吸收特定波长光线并发射更长波长光线的分子），主要用于免疫检测实验的信号放大与可视化，是免疫荧光、流式细胞术、免疫组化等技术的关键成分之一。

荧光二抗的作用原理

核心工作原理

首先，未标记的一抗 会与样本中的目标抗原（如蛋白质、多肽等物质）特异性结合，形成抗原 - 抗体复合物。

其次，荧光二抗的作用靶点不是抗原，而是一抗的恒定区（Fc 段），荧光二抗能特异性识别并结合已结合抗原的一抗，形成 抗原 - 一抗 - 荧光二抗的三级复合物。

最后二抗上的荧光基团（如 FITC、Cy3、Alexa Fluor 系列）在特定波长激发光的照射下，会发出特定波长的荧光。通过荧光显微镜、流式细胞仪等设备检测荧光信号的位置和强度，就可以判断目标抗原的表达位置、分布情况和相对含量了。

荧光二抗的特点

信号放大：一个抗原可结合多个一抗，一个一抗又可结合多个荧光二抗，能够大幅放大检测信号。

通用性：同一种荧光二抗可匹配多种靶向不同抗原的一抗（只要一抗的种属来源相同，因为荧光二抗的设计不是针对抗原，而是针对一抗的恒定区，而同一物种来源的所有抗体，恒定区结构高度相似）。例如，抗鼠 IgG 荧光二抗可结合所有鼠源一抗。

多色标记：不同荧光基团（如FITC、Cy3）可标记不同种属的二抗，实现同一样本中多种抗原的同时检测（多色免疫荧光）。

荧光二抗的选择要素

1.匹配一抗的种属来源与抗体亚型（首要原则） 

种属来源需要匹配：二抗的 “抗源” 需对应一抗的 “来源物种”。 如：鼠源一抗 → 选择抗鼠 IgG 荧光二抗。 

抗体亚型匹配：多克隆一抗以 IgG 为主，选择抗 IgG（H+L）荧光二抗即可；单克隆一抗需明确亚型（如 IgG1、IgG2a），选择对应亚型特异性二抗。

2.选择适配检测设备的荧光基团

荧光基团的激发 / 发射波长需与实验设备的激发光源、滤光片参数匹配。 

3.交叉反应控制：优先选择经固相吸附处理的二抗，可减少与其他物种免疫球蛋白的交叉反应，降低背景噪声。

基于不同实验类型的二抗使用指南

1.常规WB实验：

选择Whole IgG全片段二抗

对于常规的WB实验，在基于正确的种属来源和反应物种原则上，一般选择酶标或生物素标记的没有特殊形式的全片段二抗。

2. 荧光WB实验：

选择带有荧光基团的Whole IgG二抗

与化学发光WB实验所使用的酶标记二抗不同的是，荧光WB需选择带有荧光基团的二抗（如FITC/Dylight/Alexa Fluor荧光二抗）。

3.IP后WB实验：

根据目标蛋白分子量，选择轻链特异性二抗或Fc片段特异性二抗

在IP或Co-IP实验中，IP实验及之后的WB实验的操作过程中通常会用到相同的一抗或同种属来源的一抗、这种情况下，如果使用常规无特异性的Whole IgG酶标二抗，WB实验中IP抗体变性后产生的重链（55kDa）和轻链（25kDa）都能够识别， 而此非特异的信号往往会部分甚至完全掩盖目的蛋白的信号。为了避免以上情况：

（1）选择只和重链或轻链反应的二抗

当目标蛋白位于55kDa分子量附近时，需要选择抗轻链（anti-light chain）的二抗，以避免重链的干扰；反之，当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，需要选择抗重链或抗Fc端的二抗，以避免轻链的干扰。

（2）选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰；

（3）选择HRP直接标记的WB一抗，省去二抗的步骤。

4.IHC/ICC/IF实验：

选择F(ab') 形式的二抗

在研究某些细胞和组织时（如白细胞群体：巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞等；某些组织：淋巴结，脾脏，外周血等），这些细胞或组织因表面Fc端受体过多，会与抗体分子中的Fc端相结合，从而导致非特异性结合和高背景的现象（如下图所示），俗称“假阳性”。

使用F(ab') 形式的二抗可以避免其与活细胞中的Fc受体非特异性结合，还可避免与Protein A、ProteinG的非特异性结合，从而提高实验准确性。

5. 多标记染色IF/IHC实验：

选择经预吸附处理的二抗

预吸附是一种增加二抗特异性和最小化非特异性结合的方法，通过使抗体通过一个含有固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱从而避免潜在交叉反应的物种。反应性抗体与固定化蛋白结合，而非反应性抗体通过。比如二抗预先经过人血清吸附，相当于在抗体制作过程中，该二抗可能与人样本结合的位点已经被结合，如果样本来自人源，那么该二抗就能有效避免和人样本再发生交叉反应。

在图示的预吸附过程中，大鼠和小鼠的免疫球蛋白或血清蛋白被固定在柱上。将含有大鼠、小鼠和兔二抗的样品通过柱。与大鼠和小鼠蛋白反应的抗体结合在柱上，而不反应的兔抗体通过。这些预吸附的兔二抗是理想的染色小鼠或大鼠样本的二抗。 

（1）为了防止二抗与样本，以及其他一抗种属的交叉反应，在多次标记实验中确定蛋白表达或染色富含免疫球蛋白的组织或细胞时，首先需要选择经预吸附处理的二抗，以减少这种交叉反应； 

（2）所有二抗都应尽可能的来自同一宿主物种，以此来限制二抗与来自其他物种的一抗之间的交叉反应。下图给出了一种三标实验搭配参考，因样本和三支一抗的来源分别为小鼠、山羊、兔及大鼠，应选择能够去除这几种种属交叉反应的二抗。

（3）如果一抗种属来源于不同的亚型，那么二抗则不需要来源于不同的物种，只需要选择对应的亚型特异性二抗即可。

6.一抗来源相同的双染IF实验：

选择Fab形式的二抗

有时因受限于实际的实验条件，在进行双染色的IF实验时，一抗来源于同物种。这时可以选用Fab片段二抗来进行实验，这是因为每个Fab片段二抗只含有一个抗原结合位点，因此在随后的孵育过程中不会与另一个分子相结合(即在进行顺序双标记时的第二个一抗)。

以下有两种使用Fab片段二抗进行双标记染色的方法可供大家参考：

（1）来自同一种属的两种一抗均未标记时

（2）来自同一种属的一种未标记一抗和一种或多种标记的一抗

不建议使用F(ab')2片段抗体进行双重标记实验，因为其为二价分子，含有两个结合位点。在与第一个一抗结合之后，第二个结合位点可能仍未被占据，而这个未被占据的结合位点能够与第二抗体结合，导致假阳现象。

Fab片段二抗还可用于封闭内源性免疫蛋白：

当一抗与所研究组织种属来源相同时(例如，小鼠一抗用于小鼠组织)，可以使用Fab片段二抗来阻断内源性免疫蛋白以减少背景染色，从而提高实验的准确性。

（a）未封闭的内源性免疫蛋白会与随后加入的二抗结合，干扰实验。

（b）经过Fab片段二抗封闭后，内源性免疫蛋白不会与随后加入的二抗结合。

7.流式实验：

在流式细胞术中，绝大多数抗体都预先与荧光染料偶联。这些染料好比抗体的“发光斗篷”，被仪器的激光激发后发出特定波长的光，从而被检测器捕捉并转化为我们能识别的电信号。

然而，科研中常遇到特殊情况：我们需要使用的一抗是“未偶联”的，即它本身不携带任何荧光基团。没有“发光斗篷”，仪器就无法直接“看见”它。

此时，二抗便闪亮登场。它的作用是为未偶联的一抗“披上斗篷”。

二抗是一种被荧光标记的抗体，其特异性并非针对目标蛋白，而是针对一抗本身。

它能识别并结合一抗的物种来源和抗体类型，从而将荧光信号“传递”到一抗-靶蛋白复合物上。

二抗到底是什么

二抗，就是能特异性结合 “一抗” 的抗体。二抗以其宿主物种和靶向反应性来定义。

大多数流式用二抗产自驴或山羊。这是因为产生二抗的动物（如山羊）与产生一抗的动物（如小鼠）亲缘关系越远，免疫反应就越强，能产生更高效价的二抗。

为什么多用多克隆二抗？（信号放大关键）

流式里二抗几乎都是多克隆抗体，原因很简单：

单克隆二抗：只结合一抗上一个表位

多克隆二抗：能结合一抗上多个表位

一个一抗 → 挂上多个荧光二抗 → 信号大幅放大

实验成败关键：正确的操作顺序

当你同时使用未偶联的一抗和同物种来源的偶联抗体进行多色染色时，操作顺序至关重要。一步之差，可能导致毁灭性的交叉染色。

假设场景：用未偶联的小鼠抗人CD19检测B细胞，同时用FITC偶联的小鼠抗人CD3检测T细胞。

正确顺序（必须遵守）：

先加未偶联的小鼠抗人CD19一抗，孵育，洗涤。再加荧光标记的山羊抗小鼠二抗，孵育，彻底洗涤。最后加FITC偶联的小鼠抗人CD3，孵育，洗涤上机。

在第二步彻底洗去游离的二抗，确保后续加入的CD3抗体（也是小鼠来源）不会被残留的二抗结合，从而只标记B细胞。

错误顺序（导致灾难）：

将未偶联的CD19和偶联的CD3抗体同时加入。洗涤后，加入山羊抗小鼠二抗

二抗会同时结合到CD19和CD3抗体上，导致T细胞被错误地标记上CD19的信号，B细胞的信号也会异常增强，数据完全混乱无法解读。

小结：

二抗是流式细胞术实验中强大而精妙的工具。正确使用它：

1.二抗通过识别一抗的物种和亚型来传递荧光信号。

2.当混合使用未偶联抗体和同源偶联抗体时，严格的“一抗→洗涤→二抗→彻底洗涤→其他偶联抗体”步骤是避免交叉染色的生命线。